一、實驗目的
本方案分離多株堆肥源功能微生物，進行液體搖瓶培養獲取發酵上清，依托芬蘭Kibron‑Epsilon動態界麵張力儀、Delta‑8高通量微孔檢測模組，大批量快速測定菌株胞外代謝產物的氣‑液動態表麵張力，篩查可以產出高活性生物表麵活性劑的堆肥菌種。
堆肥環境複雜，微生物代謝產生糖脂、脂肽、胞外多糖、脂蛋白等兩親代謝物，可以改變液相界麵能、促進疏水有機汙染物乳化、提升堆肥基質降解效率。高通量張力篩查能夠快速對比上百株菌株上清界麵活性，篩選優良菌株，省去複雜的代謝物提純步驟，適用於堆肥菌種的初篩工作。
二、實驗前期準備
1.儀器與耗材準備
核心儀器：Kibron‑Epsilon動態界麵張力儀用於代表性樣品精細測定動態吸附曲線；Delta‑8高通量表麵張力分析儀承擔大批量菌株快速篩查；配備Wilhelmy合金探針、帕爾貼恒溫樣品基座、石英微量樣品杯、384孔低吸附微孔板、探針火焰清潔組件、數據采集軟件。
輔助設備：超淨工作台、恒溫振蕩搖床、高速冷凍離心機、pH計、0.22 μm水係濾膜、超聲清洗儀、無菌離心管、一次性無菌取樣管。
實驗耗材：從腐熟堆肥分離得到的全部待測菌株、通用微生物液體發酵培養基、磷酸鹽緩衝液、酸堿調節劑、18.2 MΩ超純水、無水乙醇、異丙醇。
儀器預處理規範
整機通電預熱30 min，檢測溫度設置為30 ℃，匹配堆肥微生物適宜生長溫度，全程檢測溫度保持恒定。
金屬探針每一次樣品檢測之前使用丁烷火焰灼燒，灼燒去除黏性胞外多糖、脂類殘留物，冷卻之後開展基線校準；純水平衡表麵張力穩定處於71.8~72.2 mN/m，基線連續30 min波動小於0.2 mN/m之後方可測試。
微量樣品杯、微孔板依次異丙醇擦拭、無水乙醇衝洗、純水多次潤洗之後氮氣吹幹；操作過程手部不可觸碰容器內壁，防止油脂汙染氣‑液界麵。儀器放置減震台麵，閉合防風防護罩，規避氣流擾動以及水分蒸發。
2.菌株培養、實驗組搭建以及發酵上清預處理
堆肥菌株活化和批量培養
所有待測堆肥微生物分別進行平板活化，之後轉接至液體培養基；每一株菌種設置3組生物學平行搖管，空白對照組為未接種菌株的空白發酵培養基，在相同搖床環境下培養。
培養條件設置固定轉速、溫度，統一發酵時長，保證所有菌株的培養環境一致，消除培養條件帶來的誤差。
發酵上清預處理
1.培養結束之後取出菌液，8000 r/min離心15 min，沉降菌體殘渣、固體顆粒雜質，緩慢吸取上層澄清上清液；
2.上清含有細小菌體碎屑的時候選用0.22 μm水係濾膜緩慢過濾；液體清澈透亮直接跳過過濾工序，避免疏水表麵活性代謝物吸附損耗；
3.待測上清放置至30 ℃之後低速超聲脫氣6‑8 min，除去溶液內部微小氣泡，超聲功率調低，防止活性代謝物受熱分解；
4.樣品現處理現測，短期存放需要4 ℃冷藏，存放時長不要超過8 h；
5.混勻離心管動作輕柔，禁止劇烈搖晃產生大量氣泡。
3.預實驗基線驗證
取空白發酵培養基上機運行90 min動態張力檢測，確認張力曲線平穩，培養基營養組分不會降低水溶液表麵張力。
選取1‑2株預實驗菌株上清測試，確認探針潤濕狀態正常，儀器能夠檢出堆肥微生物代謝產物造成的表麵張力下降。
三、標準化上機檢測完整操作流程
1.單通道Epsilon精細檢測流程
每一批篩查隨機抽取部分菌株作為代表性樣品。吸取150 μL脫氣後的發酵上清，沿著石英樣品杯內壁緩慢加注，液麵不可出現氣泡，產生氣泡則作廢重新製備樣品。
樣品杯安放於帕爾貼恒溫基座，關閉防風罩靜置10 min，穩定氣‑液界麵。
開啟動態表麵張力采集程序，采集時長90 min，保存張力‑時間曲線，讀取吸附飽和後的平衡表麵張力。
樣品檢測完畢之後火焰灼燒探針清除附著物，廢液倒掉、容器清洗晾幹之後測試下一份樣品。
2.Delta‑8高通量大批量菌株篩查流程
1.依照編號順序將所有菌株的發酵上清添加進384孔低吸附微孔板，單孔添加50 μL待測上清；
2.微孔板加蓋恒溫靜置平衡25 min，減少水分揮發；
3.將微孔板放置恒溫載板，啟動自動序列檢測，每個微孔重複檢測三次，取平均值作為該菌株上清平衡表麵張力；
4.整塊微孔板檢測結束之後開啟探針陣列高溫灼燒清潔；每隔二十個樣品設置空白培養基對照孔，實時監控基線漂移。
3.平行樣品質控標準
同一菌株三份平行上清測得的平衡表麵張力差值大於0.5 mN/m時，樣品重新離心、脫氣複測。全部待測菌株樣品的檢測溫度、靜置時長、探針參數保持統一，保證篩查數據具備可比性。
4.實驗收尾和儀器養護
大批量菌株篩查結束之後反複灼燒探針，清理頑固的胞外聚合物、脂類殘留物；微孔板、樣品杯乙醇浸泡之後純水衝洗晾幹。導出每一株菌株對應的平衡表麵張力、動態吸附曲線，做好菌株編號對應記錄；探針放置防塵幹燥存放。
四、數據處理與優良產活菌株篩選
1.關鍵界麵參數提取
提取吸附誘導時長、張力下降速率、平衡表麵張力；以菌株編號為橫軸、平衡表麵張力作為縱軸製作數據表。水溶液平衡表麵張力越低，則該菌株胞外代謝物界麵活性越強。
2.菌株活性分級篩查
將所有待測菌株劃分等級，表麵張力下降幅度最大的前部分菌株判定為高活性產表麵活性劑菌種；表麵張力和空白培養基接近的菌株判定為低活性菌株。
對比張力下降速率，數值越快代表胞外兩親物質吸附至氣‑液界麵的速度更快。
3.後續試驗規劃
初篩得到的優勢菌株，可以繼續開展發酵動力學、不同pH以及鹽度耐受性、代謝產物組分鑒定等後續試驗。
五、關鍵實驗控製要點
1.堆肥微生物代謝產物成分複雜，黏性多糖、腐殖質、脂類極易粘附探針，每一次檢測結束都需要灼燒清潔探針；樣品按照編號順序依次檢測，減少高活性樣品殘留汙染低活性菌株上清。
2.全程恒定檢測溫度，溫度改變會影響代謝物分子擴散速度、膠束聚集狀態，幹擾多組菌株之間對比結果。
3.全部菌株的培養周期、培養基、轉速、溫度保持一致，培養條件不一致則篩查結果沒有參考意義。
4.禁止劇烈震蕩發酵上清，氣泡會消耗溶液當中兩親性代謝物，造成動態吸附曲線失真。
5.上清清澈就跳過過濾操作，疏水脂肽、糖脂容易吸附在濾膜，造成測得表麵張力偏高，誤判菌株活性。
6.堆肥上清含有微量腐殖顆粒，長時間檢測留意樣品狀態，出現懸浮顆粒析出時更換新鮮待測液。
