一、實驗目的
本方案將Biosescreen‑C Pro全自動微生物生長曲線分析儀與芬蘭Kibron係列界麵張力檢測儀聯用，同步監測目標菌株全周期菌體生長濁度以及發酵上清動態表麵張力，搭建菌體生長動力學‑胞外表麵活性物質分泌動力學對應關係。
Biosescreen可以不間斷自動采集OD600濁度數據，獲取延滯期、對數生長期、穩定期、衰亡期完整生長參數；定時取出平行培養菌液，經由Kibron張力儀測定表麵張力、油水界麵張力、臨界膠束濃度。以此判斷生物表麵活性劑的合成啟動節點、分泌峰值和菌體生長階段的耦合規律，篩選高產表麵活性代謝物的培養條件。
二、實驗前期準備
1.儀器與耗材準備
核心儀器
Biosescreen‑C Pro全自動生長曲線分析儀、芬蘭Kibron‑Epsilon動態界麵張力儀、Kibron Delta‑8高通量表麵張力檢測儀；配套Biosescreen原廠蜂窩微孔培養板、透氣蓋板；Kibron耐腐蝕Wilhelmy合金探針、帕爾貼恒溫樣品基座、石英微量樣品杯、低吸附96孔檢測板、探針火焰清潔組件、兩台設備配套數據采集軟件。
輔助設備
超淨工作台、高速冷凍離心機、0.22 μm水係低吸附濾膜、超聲清洗儀、pH計、無菌一次性取樣管、離心管。
實驗耗材
待測產表麵活性劑菌株、滅菌液體發酵培養基、磷酸鹽緩衝液、酸堿調節試劑、18.2 MΩ超純水、無水乙醇、異丙醇。
兩台儀器預處理規範
Biosescreen儀器提前開機預熱30 min，檢查腔體濕度、震蕩模組、光學檢測模塊正常；設置菌株適配培養溫度，後續全程恒溫。蜂窩板檢測波長固定600 nm，開啟間歇震蕩模式，防止菌體沉降堆積。
Kibron張力儀通電預熱30 min，檢測溫度和Biosescreen培養溫度保持一致。合金探針每次測試前丁烷火焰灼燒除雜，冷卻之後零點校準；純水表麵張力穩定處於71.8~72.2 mN/m，基線三十分鍾波動小於0.2 mN/m方可開始檢測。所有檢測容器依次異丙醇擦拭、乙醇衝洗、超純水潤洗之後氮氣吹幹，操作過程禁止觸碰容器內壁。張力儀器放置減震台麵，閉合防風防護罩，減少水分蒸發。
2.實驗組搭建、蜂窩板接種和定時取樣規劃
菌株活化與微孔板接種
挑取活化完成的單菌落配製標準化菌懸液，統一初始菌體濃度；向Biosescreen蜂窩培養孔添加定量培養基與菌液，設置空白培養基對照組、3組生物學平行孔位。蓋上透氣蓋板放置進Biosescreen腔體。
儀器參數設定
設置培養溫度、間歇振蕩；OD讀取間隔設置為30 min，整體培養時長根據菌株生長周期設定；儀器自動全天候記錄全部孔位濁度生長曲線。
同步取樣方案
額外準備和蜂窩板培養基、接種量、溫度條件完全一致的搖瓶平行培養組，搖瓶環境參數和Biosescreen腔體保持統一。每隔兩小時無菌吸取搖瓶菌液，當作Kibron張力檢測樣品；搖瓶組作為取樣專用，避免反複開啟Biosescreen艙門，造成溫度波動、雜菌汙染，幹擾生長曲線穩定性。
發酵上清預處理
1.取出定時采集的菌液，8000 r/min常溫離心15 min，沉降全部菌體和固體雜質，緩慢吸取上層澄清發酵上清；
2.上清肉眼可見菌體碎屑，則選用低吸附水係濾膜緩慢過濾；液體清澈透亮直接跳過過濾步驟，規避疏水表麵活性劑被濾膜吸附損耗；
3.待測上清恒溫至設定溫度，低速超聲脫氣8 min，調低超聲功率，防止活性代謝物受熱分解；
4.樣品現處理現測，短期存放溫度控製在4 ℃，存放時長不可超過8 h；
5.混勻離心管動作輕柔，禁止劇烈搖晃產生氣泡。
3.預實驗基線驗證
空白培養基分別上機進行Biosescreen濁度掃描、Kibron動態張力檢測；確認空白培養基OD數值穩定，同時培養基不會降低水溶液表麵張力。選取發酵中後期上清開展預測試，探針潤濕狀態正常，儀器可以檢出胞外代謝物引發的表麵張力下降。
三、標準化上機檢測完整操作流程
1.Biosescreen菌株生長監測操作流程
將裝好菌液的蜂窩微孔板平穩放入儀器內部卡槽，關閉密閉艙門。
軟件開啟自動監測程序，保存每半個小時的OD600原始數據，實時生成菌株生長曲線。
整個培養周期之內不要開啟艙門，防止溫度、水汽、氧氣環境產生變動；觀察儀器震蕩、溫控、光學掃描運行狀態，出現孔位菌體沉降異常及時標記作廢。
培養結束之後導出全部時序濁度數據，清洗蜂窩微孔板晾幹收納。
2.Kibron張力儀時序樣品檢測流程
單通道Epsilon精細檢測
吸取150 μL脫氣後的定時發酵上清，沿著石英樣品杯杯壁緩慢加注，液麵不得產生氣泡，帶有氣泡的樣品作廢重新製備。
樣品杯放置帕爾貼恒溫基座，關閉防風罩靜置10 min，穩定氣‑液界麵。
開啟動態表麵張力采集程序，采集時長90 min，儲存張力‑時間吸附曲線，讀取吸附飽和後的平衡表麵張力；需要測試乳化性能時添加油相測定油水界麵張力。
一份樣品檢測結束之後火焰灼燒探針清除黏性代謝殘留物，廢液倒掉、樣品杯清洗晾幹之後檢測下一個時間節點樣品。
Delta‑8高通量平行樣品篩查
各個時間梯度待測上清添加進96孔低吸附微孔板，單孔添加50 μL樣品；微孔板加蓋恒溫靜置平衡30 min。
啟動自動序列檢測程序，每個微孔重複三次檢測取平均值。整板檢測結束之後灼燒清潔探針陣列，定時放置空白對照孔監控基線漂移。
3.平行樣品質控標準
同一取樣時間三組平行上清平衡表麵張力差值大於0.5 mN/m，則樣品重新離心脫氣複測。Biosescreen平行孔生長曲線偏差過大，判定該孔菌體汙染，剔除對應數據。兩台設備的溫度參數全程保持統一，保障生長數據、張力數據可以一一對應。
4.實驗收尾以及儀器養護
Biosescreen腔體擦拭除菌，蜂窩培養板浸泡清洗；Kibron探針反複灼燒去除多糖、脂肽殘留物，全部樣品容器純水浸泡衝洗，乙醇擦拭晾幹。導出每一個取樣時間點OD濁度、平衡表麵張力、動態吸附曲線，做好時間軸對應歸檔，探針幹燥防塵存放。
四、數據處理，生長‑表麵活性關聯解析
1.關鍵參數提取
從Biosescreen生長曲線計算延滯期時長、對數期比生長速率、最大菌體OD值、穩定期持續時長。
從Kibron張力曲線提取吸附誘導時長、張力下降速率、平衡氣液表麵張力、油水界麵張力；配製濃度梯度樣品測定不同發酵時段胞外活性劑臨界膠束濃度CMC。
2.生長階段和表麵活性物質耦合分析
延滯期，菌體適應環境，OD數值幾乎沒有上漲，胞外活性物質分泌量低，發酵上清表麵張力接近空白對照組。
對數生長期，菌體快速增殖代謝，OD快速升高，胞外兩親代謝物開始大量釋放，體係表麵張力快速下降。
穩定期，菌體生物量到達峰值，表麵活性劑持續累積，界麵張力下降至最低值。
衰亡期，菌體裂解，部分胞外活性劑被胞外酶降解消耗，界麵張力逐步回升。
3.工藝參數優化
對照多條生長‑張力時序曲線，確定表麵活性劑開始合成、活性到達峰值對應的菌體生長階段；對比不同pH、碳源、溫度實驗組，找到菌體生長旺盛同時高產生物表麵活性劑的培養條件。
五、關鍵實驗控製要點
1.取樣搖瓶和Biosescreen微孔板培養環境必須完全一致，否則菌體生長進度不一致，生長曲線和張力數據無法匹配。Biosescreen艙門禁止頻繁開啟，防止培養環境擾動。
2.發酵上清含有黏性胞外聚合物，每次張力測試結束灼燒清潔探針；樣品檢測順序遵循取樣由早至晚，規避高濃度代謝物殘留汙染早期樣品。
3.兩台儀器溫控數值保持一致，溫度變化會改變菌體增殖速度、生物表麵活性劑膠束結構，造成兩組實驗數據出現偏差。
4.發酵上清禁止劇烈震蕩，人為氣泡會消耗界麵活性分子，造成動態吸附動力學曲線失真。
5.上清澄澈透亮時跳過濾膜過濾工序，疏水型生物表麵活性劑極易吸附在濾膜表麵，造成測得表麵張力偏高。
6.可以同步檢測發酵液pH值，將酸堿度、菌體濁度、界麵張力三類時序參數結合，完整解析菌株代謝動力學特征。
