一、實驗目的
本方案針對大批量油田來源分離菌株進行培養，利用芬蘭Kibron‑Delta‑8高通量表麵張力檢測儀完成快速初篩，依靠發酵上清油水界麵張力、氣‑液表麵張力數值，初步篩選能夠分泌生物表麵活性劑、具備原油降解潛力的功能菌株。
原油屬於疏水有機物質，微生物分泌的糖脂、脂肽類胞外活性劑可以降低油水界麵張力，乳化分散原油，為菌體接觸、降解石油烴創造條件。界麵張力越低代表菌株代謝產物乳化原油的能力越強；該初篩方式無需複雜的原油降解定量檢測，可以一次性處理上百份菌株樣品，縮減大規模菌種篩選的工作量。
二、實驗前期準備
1.儀器與耗材準備
核心儀器選用芬蘭Kibron Delta‑8高通量表麵張力分析儀，負責大批量菌株樣品快速篩查；搭配Epsilon動態界麵張力儀用於初篩優勢菌株做動態吸附曲線複核；配置Wilhelmy合金探針、帕爾貼恒溫樣品基座、石英微量樣品杯、384孔低吸附微孔板、探針火焰灼燒清潔組件、儀器配套采集軟件。
輔助設備包含超淨工作台、恒溫振蕩搖床、高速冷凍離心機、pH計、0.22 μm低吸附水係濾膜、超聲清洗儀、無菌離心管、一次性無菌取樣管。
實驗耗材為油田汙泥、油水樣本分離得到的全部待測菌株、以原油為唯一碳源的篩選培養液、磷酸鹽緩衝液、酸堿調節劑、18.2 MΩ超純水、無水乙醇、異丙醇、油田現場原油。
儀器預處理規範
整機通電預熱30 min，檢測溫度設置30 ℃，和降解菌株搖瓶培養溫度保持恒定。
合金探針每一次樣品檢測之前使用丁烷火焰灼燒，清除探針表麵粘附的脂類、胞外多糖殘留物，冷卻之後執行零點校準；純水的平衡表麵張力穩定處於71.8~72.2 mN/m，基線連續30 min波動小於0.2 mN/m之後再開啟檢測工作。
微量樣品杯、384孔微孔板依次異丙醇擦拭、無水乙醇衝洗、超純水多次潤洗之後氮氣吹幹；操作期間手部禁止觸碰容器內壁，防止油脂汙染氣‑液、油水界麵。儀器放置減震台麵，關閉防風防護罩，減少樣品水分蒸發和揮發。
2.菌株培育、實驗組搭建以及發酵上清預處理
大規模菌株活化和搖瓶培養
所有從油田環境分離獲得的候選菌株，在固體平板完成傳代活化；之後轉接至原油唯一碳源液體培養基。每一株菌種設置三組生物學平行搖瓶；空白對照組設置未接入菌株的原油無菌培養液，放置在相同搖床環境同步培養。
全部搖瓶統一培養轉速、溫度、發酵時長，保證所有菌株培養條件一致，消除培養環境帶來的實驗誤差。
發酵上清預處理
1.培養結束之後取出菌液，8000 r/min常溫離心15 min，沉降菌體、原油懸浮顆粒和固體雜質，緩慢吸取上層澄清發酵上清；
2.上清當中殘留細小油滴和菌體碎屑的時候選用低吸附水係濾膜緩慢過濾；液體清澈透亮直接跳過過濾工序，避免疏水生物表麵活性劑被濾膜吸附損耗；
3.待測上清放置至30 ℃恒溫之後低速超聲脫氣6‑8 min，調低超聲功率，防止高溫造成表麵活性物質分解；
4.樣品現處理現測，短期存放條件為4 ℃冷藏，存放時長不能超過8 h；
5.顛倒離心管的時候動作輕柔，禁止劇烈搖晃產生大量氣泡以及乳化油滴。
3.預實驗基線驗證
取空白原油培養基上機開展90 min氣‑液以及油水界麵張力測試，確認空白培養液本身不會大幅度降低油水界麵張力。
選取2至3株待測菌株上清開展預測試，確認探針潤濕正常，儀器可以檢出胞外活性劑引發的界麵張力下降。
三、標準化上機檢測完整操作流程
1.Delta‑8高通量大批量菌株初篩流程
1.按照菌株編號順序將所有待測發酵上清添加進384孔低吸附微孔板，單孔添加50 μL待測上清；
2.微孔板加蓋之後恒溫靜置平衡25 min，減少水分揮發；
3.將微孔板安置在恒溫載板，啟動儀器自動序列檢測程序；優先測定油水界麵張力，每一個微孔重複檢測三次，取平均值作為該菌株上清界麵張力結果；
4.整塊微孔板檢測結束之後開啟探針陣列高溫灼燒清潔；每隔二十個樣品孔放置空白培養基對照孔，用來實時監控基線漂移情況。
2.Epsilon儀器對候選優勢菌株精細複核
高通量篩查結束之後，挑選界麵張力較低的潛力菌株，使用單通道Epsilon動態界麵張力儀測定完整的張力‑時間吸附動力學曲線。
吸取150 μL脫氣後的發酵上清沿著石英樣品杯內壁緩慢加注，液麵不可出現氣泡。樣品杯安放於帕爾貼恒溫基座，關閉防風罩靜置10 min。
開啟采集程序，采集時長設置90 min，保存動態吸附曲線，讀取平衡油水界麵張力數值。
單份樣品檢測結束之後火焰灼燒探針清除油汙和黏性代謝殘留物，廢液倒掉、容器清洗晾幹之後繼續下一組樣品檢測。
3.平行樣品質控標準
同一菌株三份平行上清測得的油水平衡界麵張力差值大於0.5 mN/m，樣品需要重新離心、脫氣之後複測。全部待測菌株樣品檢測溫度、靜置時長、探針下落參數保持統一，保障多組菌株的數據具備橫向對比條件。
4.實驗收尾和儀器養護
大規模菌株篩查工作結束之後反複灼燒探針，清理頑固油相附著物、胞外聚合物殘留；微孔板、樣品杯使用有機溶劑浸泡除油之後純水衝洗晾幹。導出每一株菌株對應的油水界麵張力和氣液表麵張力數據，綁定對應的菌株編號；探針放置幹燥防塵環境存放。
四、數據處理、原油降解潛力菌株篩選標準
1.關鍵界麵參數提取
提取界麵吸附誘導時長、張力下降速率、氣‑液平衡表麵張力、油水界麵張力，整理成菌株‑界麵張力數據表。油水界麵張力數值越低，菌株分泌出的生物表麵活性劑乳化原油的性能越強。
2.菌株分級初篩
按照油水界麵張力數值劃分等級，篩選出界麵張力最低的一批菌株當作優勢候選菌種；油水界麵張力和空白對照組接近的菌株判定為低活性菌株直接篩除。
對比張力下降速率，下降速度越快代表胞外兩親物質可以快速鋪展至油水界麵，乳化響應速度優異。
3.後續深度試驗規劃
經過Kibron張力初篩得到的優勢菌株，接下來開展原油烴降解率測定、耐鹽耐溫測試、發酵條件優化等進階試驗。
五、關鍵實驗控製要點
1.油田菌株發酵上清含有原油油滴、黏性胞外聚合物，油汙極易粘附金屬探針，每一次檢測結束都需要灼燒清潔探針；樣品檢測順序依照編號依次篩查，規避高活性代謝物、油汙殘留汙染低活性菌株樣品。
2.全程恒定檢測溫度，溫度浮動會改變生物表麵活性劑膠束結構、原油黏度，幹擾油水界麵張力對比結果。
3.所有候選菌株的培養基、碳源、培養周期、搖床轉速必須統一，培養條件不一致時，篩查結果不具備可比性。
4.禁止劇烈震蕩發酵上清，人為產生的氣泡會消耗溶液當中兩親活性分子，造成動態吸附動力學曲線失真。
5.上清液體清澈透亮時跳過濾膜過濾步驟，脂肽、糖脂類疏水活性劑極易被普通濾膜吸附，造成測得界麵張力偏高，錯過高產活性物質菌株。
6.檢測油水界麵張力時原油取用油田原位原油，不要使用替代油品，保證篩選條件貼合油田實際環境。
