一、實驗目的
土壤浸提液組分複雜、可溶性微生物代謝產物含量偏低、可供檢測的樣品體積有限，屬於典型微量待測體係。本操作規範利用芬蘭Kibron‑Epsilon微量樣品檢測模式、Delta‑8高通量微孔板微量進樣，完成低體積土壤浸提發酵上清的動態表麵張力、油水界麵張力測定，檢測土壤微生物胞外多糖、生物表麵活性劑、脂類代謝物的界麵活性；針對微量體係容易出現的樣品損耗、雜質汙染、水分蒸發等問題建立標準化前處理與上機流程，保障低含量代謝物測試數據可靠。
二、實驗前期準備
1.儀器與耗材準備
核心儀器：搭載微量樣品檢測組件的Kibron‑Epsilon動態界麵張力儀、Kibron Delta‑8高通量表麵張力分析儀；配件包含微型Wilhelmy合金探針、小型石英微量樣品池、低吸附96‑well微孔板、帕爾貼恒溫基座、探針火焰灼燒清潔組件、配套檢測軟件。
輔助設備：超淨工作台、高速冷凍離心機、0.22 μm低吸附水係濾膜、水浴恒溫槽、超聲清洗儀、微量移液槍、低吸附微量離心管。
實驗耗材：供試土壤樣品、無菌液體培養基、磷酸鹽緩衝液、酸堿調節劑、超純水、無水乙醇、異丙醇。
2.儀器預處理規範
1. 張力儀器提前通電預熱30 min，設置檢測溫度25 ℃，全程溫控波動控製在±0.2 ℃。
2. 微型合金探針每次測試前使用丁烷火焰充分灼燒，燒掉粘附的胞外聚合物、土壤有機質殘留物，冷卻之後開展純水零點校準；純水表麵張力穩定處於71.8~72.2 mN/m，基線連續30 min波動小於0.2 mN/m才可啟動微量檢測。
3. 微量樣品池、微孔板依次異丙醇擦拭、無水乙醇衝洗、超純水多次潤洗之後氮氣吹幹；微量體係極易被手上油脂、塵埃汙染，操作全程隻能捏住容器外壁。
4. 儀器放置減震台麵，閉合防風防護罩，減少微量試液水分快速蒸發造成代謝物濃縮。
3.土壤浸提液製備、微生物培養以及微量待測液預處理
1. 土壤浸提原液製備：稱取風幹土壤，按照固液比例加入無菌純水，恒溫震蕩浸提，離心之後獲取上層土壤浸提液，作為微生物培養液基質。
2. 土壤源微生物富集培養：使用土壤浸提液配製培養液，接種土著微生物，恒溫搖床振蕩發酵；設置空白對照組為未經微生物培養的無菌土壤浸提液；每組準備多份平行發酵體係。
3. 微量上清獲取：吸取發酵菌液，8000 r/min常溫離心15 min，沉澱菌體、土壤細小顆粒雜質，小心吸取上層澄清發酵浸提上清；單次待測樣品體積隻保留需要檢測的微量規格。
4. 上清精細化預處理
試液肉眼含有細小懸浮顆粒時選用低吸附水係濾膜緩慢過濾；溶液清澈通透直接跳過過濾步驟，防止微量疏水代謝物吸附損耗；
將微量離心管放置恒溫水浴平衡至檢測溫度；低功率超聲脫氣5 min，清除試液內部微型氣泡；
微量試液禁止劇烈顛倒搖晃，避免產生氣泡消耗氣‑液界麵活性物質；樣品現處理現上機，微量體係揮發速度快，常溫存放時長不可超過3 h。
4.預實驗基線驗證
取空白無菌土壤浸提液上機進行90 min動態張力檢測，確認空白浸提液有機質不會造成表麵張力大幅度浮動；選取一份發酵後的微量浸提上清預測試，確認微型探針潤濕狀態正常，可以捕捉微生物代謝物帶來的張力下降。
三、標準化上機檢測完整操作流程
1.Kibron‑Epsilon微量樣品池精細檢測
1. 使用微量移液槍吸取足量微量脫氣浸提上清，緩慢注入微型石英樣品池，加注過程貼著杯壁緩慢流入，杜絕氣泡生成；出現氣泡則廢棄試液重新製備。
2. 將微量樣品池安放至恒溫帕爾貼基座，關閉防風罩靜置12 min，試液溫度和氣‑液界麵達到平衡。
3. 在軟件開啟微量模式，啟動動態表麵張力采集，檢測時長設置90 min，記錄完整吸附動力學曲線，讀取吸附誘導時長、張力下降速率、平衡表麵張力；如需測定疏水代謝物乳化性能，添加微量原油測試油水界麵張力。
4. 單次測試結束之後升起微型探針，火焰灼燒清理土壤有機質和黏性胞外代謝物殘渣，倒掉微量廢液，樣品池清洗晾幹之後進行下一組樣品。
2.Delta‑8微孔微量進樣高通量篩查
1. 使用移液槍向96孔低吸附微孔板每一個孔位加入50 μL微量土壤浸提待測液；微孔板蓋上蓋板減少水分揮發。
2. 微孔板放置恒溫載板恒溫平衡30 min。
3. 開啟儀器自動檢測程序，每個微孔重複檢測三次，取平均值作為最終界麵張力結果。
4. 整板測試結束之後高溫灼燒清潔探針陣列；每隔10個樣品孔放置空白土壤浸提對照孔，實時監測基線漂移。
3.平行樣品質控標準
同一平行土壤浸提三份微量試液測得平衡界麵張力差值大於0.5 mN/m，樣品需要重新脫氣複測；全部微量樣品檢測溫度、界麵靜置時長、探針下降參數保持統一。
4.實驗收尾和儀器養護
檢測完畢之後反複灼燒微型探針，清除頑固土壤腐殖質、多糖殘留物；微量樣品池、微孔板采用溫水浸泡去除有機質，乙醇擦拭晾幹。導出全部浸提樣品動態張力曲線與參數，探針放置幹燥防塵環境存放。
四、數據處理和代謝物界麵活性解析
1. 提取各項動力學參數：界麵吸附誘導時間、表麵張力下降速率、平衡氣‑液表麵張力、油水界麵張力。
2. 和空白無菌土壤浸提液進行對照，扣除土壤原生有機質帶來的張力幹擾，計算微生物代謝產物造成的表麵張力下降幅度。
3. 對比不同培養時長、不同土壤組別浸提液張力參數，篩選可以分泌高活性表麵活性代謝物的土著微生物；還可探究pH、鹽度對微量代謝物界麵特性帶來的影響。
五、微量體係專屬關鍵控製要點
1. 微型探針極易粘附土壤腐殖質、黏性胞外聚合物，每一次微量樣品檢測之後必須灼燒除雜；檢測順序由低活性樣品至高活性樣品，規避殘留物汙染微量試液。
2. 嚴控檢測溫度恒定，微量體係溫度波動會加快水分揮發，快速濃縮微生物代謝物，帶來巨大檢測誤差。
3. 微量試液體積少、極易揮發，上機之前再打開離心管，縮短敞口放置時長。
4. 全程做好除氣泡操作，微量體係內部微小氣泡便會消耗大部分表麵活性分子，讓吸附動力學曲線失真。
5. 試液清澈時省去過濾步驟，微量的脂肽、糖脂類疏水代謝物極易吸附在濾膜內壁，造成測得表麵張力偏高，誤判代謝物活性。
6. 關閉防風防護罩，空氣流動會加速微量試液蒸發，同時擾動氣‑液界麵，幹擾最終檢測結果。
