一、實驗目的

從受重金屬汙染土壤分離得到多株修複功能微生物，開展液體搖瓶發酵；借助芬蘭Kibron界麵張力檢測儀測定發酵上清液氣‑液表麵張力、油水界麵張力以及動態吸附曲線，定量對比不同菌株分泌生物表麵活性劑的性能。依靠界麵動力學各項指標，篩選出產表活能力優秀的菌株，探究環境條件對於胞外活性代謝產物的影響，為重金屬淋溶修複菌種篩選、培養條件優化提供量化檢測手段。

二、實驗前期準備

1.儀器與耗材準備

核心儀器選用Kibron‑Epsilon動態界麵張力儀，用來采集發酵上清動態表麵張力曲線；Delta‑8高通量張力分析儀用於大批量菌株樣品快速篩查。配套Wilhelmy合金探針、帕爾貼恒溫基座、石英微量樣品杯、低吸附96孔微孔板、探針火焰灼燒清潔組件、儀器配套的數據采集軟件。

輔助設備包含超淨工作台、恒溫振蕩搖床、高速冷凍離心機、pH檢測儀、超聲波清洗儀、無菌離心管、重金屬汙染土壤浸出培養液、濾器。

實驗耗材為多株土壤重金屬修複功能菌、基礎發酵培養基、重金屬離子母液、磷酸鹽緩衝液、酸堿調節劑、超純水、無水乙醇、異丙醇。

2.儀器預處理規範

設備提前通電預熱三十分鍾，檢測溫度設置為菌株最適培養溫度，溫控保持穩定。

每一次測試之前使用明火灼燒金屬探針，燒掉探針表麵粘附的多糖、脂肽類胞外殘留物，探針冷卻之後進行純水基線校準。等到純水表麵張力長時間穩定，基線沒有明顯浮動之後，方可開始樣品檢測。

樣品杯、微孔板依次使用異丙醇、無水乙醇、超純水衝洗幹淨，氮氣吹幹。操作過程手部不要觸碰容器內側，皮膚油脂會幹擾氣‑液界麵。儀器放置在減震台麵，關閉防風防護罩，避免空氣流動擾動液麵以及加速水分蒸發。

3.實驗組搭建以及發酵上清預處理

首先將所有待篩選的功能菌株在固體培養基傳代活化，挑取單菌落製備菌懸液。

設置搖瓶實驗組，分為空白對照組、單一菌株發酵組；還可以添加不同重金屬濃度、酸堿度、溫度的變量組別，探究脅迫環境對菌株產表活的影響，每一組準備三組平行搖瓶。

所有搖瓶保持一致的轉速、溫度與培養時長。培養結束之後取出菌液，使用高速離心機分離菌體沉澱，吸取上層澄清發酵液。

上清液肉眼可見細小菌體碎屑時選用低吸附水係濾膜緩慢過濾；液體通透幹淨就跳過過濾步驟，防止疏水型生物表麵活性劑被濾膜吸附損耗。

發酵上清輕柔顛倒混勻，低溫低速超聲脫氣，除去溶液內部微小氣泡，氣泡會消耗界麵活性分子，幹擾後續張力檢測結果，樣品做到現處理現測試。

4.預實驗基線驗證

空白發酵培養液上機開展動態表麵張力測試，確認空白培養基本身不會降低水相表麵張力。選取其中一株菌株的發酵上清進行預檢測，確認探針潤濕狀態正常，儀器可以捕捉表麵活性劑造成的張力下降曲線。

三、標準化上機檢測完整操作流程

1.Kibron‑Epsilon動態表麵張力精細檢測流程

吸取一百五十微升脫氣完畢的發酵上清，沿著石英樣品杯杯壁緩慢倒入，液麵內部不能出現氣泡。

樣品杯放置恒溫基座，閉合防風罩靜置十分鍾，液麵溫度和氣‑液界麵達到穩定。

開啟張力采集程序，持續采集一百二十分鍾的時間‑動態表麵張力曲線，完整記錄活性物質向界麵吸附全過程的數據。

樣品檢測結束之後升起探針，火焰灼燒清理附著物，倒掉廢液、清洗晾幹樣品杯。檢測順序依照菌株樣品從預估低活性至高活性依次進行，規避高濃度表活殘留汙染後續樣品。

如果需要評估活性劑對於疏水重金屬附著物的潤濕能力，可以繼續開展油水界麵張力測試。

2.Delta‑8高通量批量菌株篩查流程

各個菌株發酵上清添加至96孔低吸附微孔板，微孔板加蓋之後恒溫靜置平衡。

啟動儀器自動檢測程序，每一個檢測孔重複檢測三次，取平均值當作最終檢測數值。批次檢測期間每隔十個樣品放入空白培養基對照孔，隨時監控儀器基線漂移。

3.菌株產表活能力配套輔助試驗

留存各組發酵上清，記錄發酵液pH、菌體生物量；後續可開展重金屬淋溶試驗，對照菌株表活指標和重金屬洗脫效果之間的聯係。

4.平行樣品質控標準

同一菌株三份平行上清測得平衡表麵張力差值偏大的時候，樣品需要重新離心脫氣複測。全部樣品的檢測溫度、靜置時長、探針下落參數保持統一，保障不同菌株的數據具備可比性。

5.實驗收尾和儀器養護

全部樣品測試結束之後反複灼燒探針，清除頑固的胞外聚合物殘留；所有容器經過乙醇浸泡衝洗、晾幹存放。導出每一株菌株的靜態張力數值、動態吸附曲線數據，探針放置幹燥防塵環境保存。

四、基於Kibron檢測數據的定量評價方法

1.從動態張力曲線提取定量參數

吸附誘導時長，代表菌株代謝出來的活性分子遷移抵達氣液界麵所需時間。

表麵張力下降速率，用來表征活性分子的界麵擴散速度。

平衡表麵張力，界麵吸附飽和之後穩定的最低張力數值，該數值越低代表產表活性能越強。

達到界麵吸附平衡消耗的時長。

2.分級定量評價標準

對比空白培養基的表麵張力，計算每一份發酵上清的張力下降幅度。

按照平衡表麵張力劃分等級，張力下降幅度越高，菌株分泌生物表麵活性劑能力越強；再結合吸附動力學速度，綜合評判活性劑分子鋪展效率。

對比不同重金屬脅迫組別張力參數變化，判斷重金屬脅迫是否能夠刺激功能菌分泌更多胞外活性物質。

結合菌體生長量，計算單位菌體產出的表活界麵活性，消除菌體生物量差異帶來的幹擾，客觀對比菌株產表活水平。

3.篩選和條件優化

優先挑選平衡表麵張力低、界麵吸附速度快的優勢菌株。依托多組環境變量試驗，確定能夠刺激菌株高效合成表麵活性劑的溫度、酸堿度、重金屬濃度條件。

五、關鍵實驗控製要點

1.發酵上清含有黏性EPS和脂肽殘留物，每次檢測之後探針必須灼燒清理幹淨，防止殘留物幹擾後續樣品。

2.嚴格把控檢測溫度，溫度改變活性分子擴散速率以及膠束形態，容易造成評價偏差。

3.待測上清一定要脫除微氣泡，殘留氣泡會消耗活性單體，動態張力檢測結果出現誤差。

4.上清液清澈就不要過濾，疏水類生物表麵活性劑很容易吸附在濾膜表層，低估菌株產表活能力。

5.所有菌株的搖瓶培養條件統一，菌體生長情況的差異需要單獨校正，保證評價結果隻來源於產表活能力區別。

6.檢測全程關閉防風罩，氣流吹動液麵會破壞氣‑液界麵，造成動態張力曲線波動。